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内毒素检测的基础知识

2019-03-05 浏览次数:359

1. 什么是内毒素?

  内毒素一种在革兰氏阴性菌细胞壁中发现的脂多糖(LPS)。它是一种典型的热原,哪怕是皮克级(10-12 g)或纳克级的(10-9 g)内毒素进入血液,也会引发各种生物反应。因为其有着耐热性和稳定性,通过高压蒸汽处理也不能完全使内毒素灭活,需在250℃或以上的温度下,干热处理至少半小时才能使其灭活。它存在于革兰氏阴性菌栖息的环境中(例如水,空气),即使在细菌死亡后,细菌性的内毒素(LPS)仍然存在。

  图1为脂多糖的结构图,如图所示,脂质A在该物质中是负责生物活性的主要部分,这部分的分子量约为2000。包含糖链部分在内的整个分子的分子量一般为5000到8000左右。然而,因为内毒素是一种同时拥有亲水区(糖链)和疏水区(脂质A)的分子,它能在水溶液中相互缔合,形成表观分子量为数十至数百万的胶束结构。有报告指出,胶束结构的变化,会影响其生物活性的强弱。

  图2所示为大肠杆菌型和沙门氏菌型的脂质A的结构。从图中能看出即使菌株不一样,脂质A的基本结构在大体上仍然相同。

 

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图1. 脂多糖(LPS)结构示意图

 

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图2. 脂质A的结构(大肠杆菌型和沙门氏菌型)

 

2. 使用鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)试剂的各种内毒素检测方法

  由马蹄蟹(美洲鲎)的阿米巴样细胞溶解物制备的试剂可用于检测细菌内毒素。如图3所示,在内毒素的参与下,级联反应开始进行,其中C因子,一种丝氨酸蛋白酶前体,zui先被活化。随后接下来的是B因子的活化,B因子也是一种丝氨酸蛋白酶前体和凝固酶前体,它能将凝集原水解成凝集素,形成不溶性凝胶。在LAL测试中,内毒素可以通过三种方式定量:对凝胶的形成进行测定,对浊度的增加进行测定,或对由合成底物分解而释放出的黄se色原体进行测定。

  普通的LAL试剂不仅与内毒素反应,而且会与(1→3)-β-D-葡聚糖(真菌细胞壁成分)反应,因为G因子途径会在LAL试剂作用下被激活。为了消除这种(1→3)-β-D-葡聚糖活化,在工业中通过去除G因子或抑制其活化,开发了各种内毒素特异性试剂。

  市场上有着各种基于图3中的反应机理所制得的LAL试剂以及检测体系。因此,根据所需的准确度、测试频率、样本数目以及其他相关因素来选择最合适的产品是十分重要的。 

 

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图3. LAL试剂反应机理

 

  美国,欧洲和日本的药典中包含了三种内毒素检测方法,分别是凝胶法、比色法和比浊法,我们会在下面的章节中详述,并且会介绍相关的LAL试剂的特点以及其应用实例。

 

(1) 凝胶法

  将样本与LAL试剂在试管中混合,并使用干浴器,在37±1°C下,孵育60±2min,期间不要振动。加热完成后,立即缓慢地将试管倾斜180°。如果凝胶已形成并能保持其完整性而不变形或塌陷,则结果可确定为阳性,而如果未形成凝胶则为阴性。在检测期间,对于一系列样本,要进行多倍稀释(通常为2倍),以检查每个样品的结果是否为阳性。确定为阳性的最大有效稀释倍数或最小浓度被称为终点。

 

4.jpg

 

相关试剂

  在单次型试剂盒和多次型试剂盒中都包含LAL试剂,其中单次型试剂盒中的反应小瓶包含了预分装好的用于单次检测的LAL试剂,而多次型试剂盒则是将所需量的已经溶解好的LAL试剂装入到反应瓶中。单次型试剂盒非常适用于少量样品的检测,而多次型试剂盒则适用于样本量更多的检测。

  多次型试剂盒的使用方法式是将0.1mL已经溶解好的LAL试剂分装到反应管中,然后再加入0.1mL样品,并将其混合。而单次型试剂盒的使用方法则是将0.2mL样本加入到含有预先分装好的LAL冻干试剂的反应小瓶中。

ES-II系列

特异性内毒素LAL试剂(不会被(1→3)-β-D-葡聚糖活化),与细菌内毒素检测(BET)(日本药典)相兼容。其胶凝灵敏度为0.015 EU/mL,单次型和多次型试剂盒均有提供。

 

(2)比色法

  由于内毒素会使LAL试剂活化,比色法是根据其对显色底物的分解来检测其活化。由于对硝基苯胺的黄色的吸光度是在405 nm波长下检测的,如果样品在约405 nm波长下具有相当大的光吸收,则不宜使用比色法。

 

相关试剂

Color KY 系列

  内毒素特异性比色法LAL试剂,与BET(日本药典)一致性测试相兼容。与Toxinometer® 结合使用的单次型试剂盒,以及与酶标仪和Toxinometer® 结合使用的多次型试剂盒,可用于动态比色测试。这些系列在我们的试剂产品有着最高的灵敏度:检测限为0.0002 EU/mL(单次型)和0.0005 EU/mL(多次型)。

 

(3)比浊法

  比浊法利用凝胶浊度的变化来检测由内毒素诱导所产生的LAL试剂的活化。它不适用于具有一定浊度的样品。

 

相关试剂

ES-F系列和ES-II系列

  在动态比浊法测量中,可以将ES-F系列、ES-II系列与酶标仪和Toxinometer® 结合使用。这些试剂盒不仅能获得凝胶法的结果,同时能得到动态比浊法的数据,测量时间为60 min。

 

3.对检测用具的要求

  用于内毒素检测的所有检测用具必须不含内毒素和β-葡聚糖。为使内毒素失活,需要在250°C下干热处理超过30 min。建议使用经干热灭菌的玻璃器皿。避免使用金属工具,因为即使有少量被洗脱出的金属离子(例如铁,铝,镓,铬),也可能影响测试。而当使用一次性塑料工具(其制造商未能保证其能用于检测用途)时,检查它们是否满足以下要求(与玻璃器皿相比):1)未被内毒素污染; 2)不吸附内毒素; 3)无洗脱物。

 

4.内毒素标准品

  根据检测目的使用适当类型的内毒素标准品。

•需符合BET(美国药典/ 欧洲药典 / 日本药典)的检测,例如药品和医疗器械的产品最终检验

→必须使用美国药典,欧洲药典或日本药典标准的内毒素国家标准品。

•对材料,工艺流程和其他相关主题的检测

→可以使用内毒素工作标准品(CSE)。

 

5. 样本干扰

  有时候需要采取预防措施,以防止样本对内毒素检测有潜在影响(反应干扰)。这些干扰分为以下两种类型:

(1)对LAL试剂的干扰

•蛋白变性剂(例如酸,碱,尿素,表面活性剂,有机溶剂)

•蛋白酶和蛋白酶抑制剂

•螯合剂(会清除反应所需的钙和镁)

•对于比色法:着色物质(在约405 nm处具有相当大吸收的物质)

•对于比浊法:浊度

(2)对内毒素的干扰

•金属离子(例如铁,铝,镓和铬离子。即使微摩尔级别的存在也会对测试产生影响)

•表面活性剂

 

  样本的干扰效果可以通过进行药典中的干扰因子测试来衡量:即通过对加标了已知量的内毒素的样本进行检测,获得加标内毒素的回收率。如果回收率在50%至200%范围内,则可以确定该样本不会造成影响,换句话说,检测所得的内毒素浓度是正确的。如果发现样本会造成影响,可以通过对样本溶液进行稀释,从而减少对测试的影响。然而,对样本溶液的稀释会提高了由原始溶液(预稀释溶液)的浓度转换而得的内毒素浓度值。合理的稀释倍数(最大有效稀释倍数),是根据待检测的内毒素的所需浓度以及所用LAL试剂的检测灵敏度来确定的。欲了解反应干扰因子和最大有效稀释度的详细信息,详见药典中的细菌内毒素检测。

 

6. Limulus ES的原理(内毒素特异性试剂)

 

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图4. 鲎试验反应级联

 

  LAL试剂和内毒素的级联反应机制如图4所示。如果反应体系中存在(1→3)-β-D-葡聚糖*,会激活G因子,引起伴有凝胶化的假阳性反应。在这种情况下,无论体系中是否存在内毒素,都会发生反应,意味着无法对内毒素进行特异性检测。为此,我们研发出Wako's Limulus ES,该产品通过在反应体系中加入过量共存的(1→3)-β-D-葡聚糖(羧甲基化凝胶多糖),从而来抑制(1→3)-β-D-葡聚糖的干扰。因此,β-葡聚糖对LAL试剂的活化受到抑制,从而使内毒素特异性检测能够进行。过量的β-葡聚糖可以抑制其自身反应的原理如图5所示:β-葡聚糖和LAL试剂之间反应的浓度范围对于整个反应而言很窄。另一方面,内毒素和鲎试剂的反应在很宽的浓度范围内都会发生,并且不受大量共存的β-葡聚糖的任何干扰。Wako的Limulus ES就是根据这个原理而制作的(见图6)。

*(1→3)-β-D-葡聚糖来源于霉菌(真菌)或经纤维素滤膜过滤所得。

 

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图5. 羧甲基化凝胶多糖和LAL反应

使用Toxinometer®(检测时间设定为99 min)和Limulus HS进行检测。

○在99 min内检测不到凝胶的生成

●有凝胶的生成

 

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图6. 羧甲基化凝胶多糖对使用Limulus HS和Limulus ES进行的内毒素检测的影响

A:Limulus HS

B:Limulus ES

○内毒素的系列稀释

▲含有1 μg/mL羧甲基化凝胶多糖的内毒素系列稀释

 

◆产品列表

产品编号

产品名称

规格

包装

295-72301

Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR™ ES-F SINGLE TEST SENSITIVITY 0.015 EU/mL (25 LAL)

for Endotoxin Detection

25 tests

291-75701

Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR™ ES-F MULTI TEST (without CSE)

for Endotoxin Detection

100 tests

295-51301

Limulus ES- II Single Test wako
鲎试剂ES- II Single(适用于溶胶凝胶法和动态比浊法)

for Endotoxin Detection

25 tests

299-51201

Limulus ES- II Test wako
鲎试剂ES- II (适用于溶胶凝胶法和动态比浊法)

for Endotoxin Detection

60 tests

292-51213

Limulus Amebocyte Lysate ES-II,Lyophilized
鲎试剂LAL ES-II(适用于溶胶凝胶法和动态比浊法)

for Endotoxin Detection

2 mL×5

293-75401

Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR™ ES-F/Plate (with CSE)

for Endotoxin Detection

160 tests

297-75301

Limulus Amebocyte Lysate PYROSTAR™ ES-F/Plate (without CSE)

for Endotoxin Detection

200 tests

291-53601

Limulus Color KY Single Test wako

for Endotoxin Detection

25 tests

291-53101

Limulus Color KY Test Wako

for Endotoxin Detection

60 tests

290-33771

Toxinometer® ET-6000/J Standard Set
内毒素检测仪ET-6000/J

1 set

 

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